李兰娟团队发现新冠病毒19个致病性新骤变

（原标题：李兰娟团队：新冠骤变影响致病性，体外感染显现270倍差异）

汹涌新闻记者 贺梨萍

现在关于新冠病毒（SARS-CoV-2）的基因组查询数据标明，病毒存在着很多的单核苷酸变异(SNVs)，此前尚无研讨标明骤变与病毒致病性的功用改动直接相关。

但是，李兰娟院士团队的最新研讨提出了直接依据，证明现在发作在新冠病毒基因组中的骤变具有影响病毒致病性的功用潜力。李兰娟团队提示：疫苗和药物的开发需求考虑到这些累积骤变，尤其是鼻祖骤变的影响，以防止潜在的缺点。

在最新的一份研讨中，来自浙江大学的研讨团队报告了11例新冠患者来历的病毒别离株的功用特征，它们都至少有一个骤变。重要的是，当感染Vero-E6细胞时，这些病毒别离株在细胞病变效应和病毒载量方面表现出显着差异，差异高达270倍。

当地时刻4月19日，浙江大学医学院隶属榜首医院盛行症诊治国家要点实验室、浙江大学生命科学研讨院、浙江省胰腺病研讨要点实验室的研讨团队在医学预印本渠道medRxiv在线宣布了一篇研评论文“Patient-derived mutations impact pathogenicity of SARS-CoV-2”。该论文通讯作者为我国工程院院士、国家卫健委高等级专家组成员李兰娟教授，浙江大学生命科学研讨院研讨员蒋超，浙江大学医学院隶属榜首医院盛行症诊治国家要点实验室吴南屏教授和郑敏教授。

现在的研讨认为，跨膜刺突糖蛋白（S蛋白）介导病毒进入宿主细胞，S蛋白依据蛋白结构功用又被分为两个功用单位，即S1和S2蛋白亚基。其间S1担任与宿主细胞受体结合，S2担任病毒和细胞膜交融。新冠病毒和SARS-CoV都运用血管严峻素转化酶2（ACE2）进入靶细胞。ACE2在人鼻上皮细胞和肺、精原细胞、间质细胞、支撑细胞、胃、十二指肠和直肠上皮细胞中表达。

论文说到，S蛋白的受体结合域（RBD）是β冠状病毒中最具变异性的基因组部分，S蛋白的某些位点或许会遭到正向挑选。不过，尽管新冠病毒具有很多的变异性，一个要害的问题依然是：这些骤变是否对新冠病毒的致病性有任何真实的功用影响？

研讨人员认为，上述问题对了解病毒感染机制至关重要，并辅导药物和疫苗的开发战略，为应对疫情大盛行下一阶段做准备。为了处理这一问题，研讨人员从浙江大学隶属榜首医院收治的患者中别离出11株新冠病毒毒株。

研讨人员在Novaseq 6000渠道上对11株病毒别离株进行超深度测序，发现病毒别离株的编码序列别离存在1-5个骤变，相同也查询到混合集体（代表病毒准种，Quasi-species）。他们一共判定出33个骤变（包括在混合集体中查询到的10个骤变），依据与GISAID在2020年3月24日供给的1111个基因组序列的比较，其间19个是新的骤变。

研讨人员还用11株病毒别离株感染了Vero-E6细胞，并定量评价了它们在感染后（P.I.）1、2、4、8、24和48小时的病毒载量，以及在感染后48和72小时的病毒性细胞病理效应（CPE）。

他们的研讨成果标明，在感染Vero-E6细胞时，查询到的骤变会对病毒载量和细胞病理效应发作直接影响，差异最高达270倍。这一发现标明，研讨中查询到的病毒骤变，能够显着影响新冠病毒的致病性，而这种骤变在全球各地搜集的病毒毒株中都或许存在。

整体而言，这项研讨供给了直接依据，证明现在发作在新冠病毒基因组中的骤变具有影响病毒致病性的功用潜力。研讨人员提示，除了不断堆集的基因组测序数据外，还应尽或许在细胞水平上进行病毒监测。最终，与流感类似，药物和疫苗的开发尽管急迫，但也需求考虑到这些累积骤变，尤其是鼻祖骤变的影响，以防止潜在的缺点。

患者盛行病学病史

本研讨中触及的11例患者的样本搜集于国内疫情爆发的前期阶段，时刻为2020年1月22日至2020年2月4日。

11例患者中有10例与武汉有清晰联络，这11人中有5人确诊前在武汉作业或游览，别的5人与居住在武汉的人有过密切触摸，剩余的1人与新冠患者有过触摸。有必要留意一下的是，患者ZJU-4、ZJU-5、ZJU-9均参与了有武汉搭档到会的同一个商务会议。

因而，依据这11例患者的盛行病学前史，他们构成了榜首代和第二代感染病例。

11例患者中男性8例，女人3例，年纪4个月至71岁不等。除1例患者外，其他一切患者均有中度或更严峻的症状，3例有合并症，1例需求ICU医治。

到该论文编撰，一切患者均已恢复。

11例患者中搜集的病毒别离株中存在多种骤变

为了评价这11株病毒别离株的骤变谱，研讨人员在Illumina Novaseq 6000渠道上对别离的病毒基因组RNA进行了超深度测序，均匀每个样本发作2.45亿个读数/67.16 Gb。

他们一共判定出33个骤变（包括在混合集体中查询到的10个骤变），依据与GISAID在2020年3月24日供给的1111个基因组序列的比较，其间19个是新的骤变。

具体来说，在ZJU-1中发现了G11083T和G26144T，这两种骤变都被认为是一个大集体病毒的鼻祖骤变。ZJU-2和ZJU-8中发现了C8782T和T28144C骤变，这两种骤变被认为是别的一个大集体病毒别离株的鼻祖骤变。

ZJU-2、ZJU-5、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11这5个病毒别离株中均发现了T22303G骤变，ZJU-5和ZJU-9在一次商业会议中露出于相同的潜在感染源。值得一提的是，此前仅在澳大利亚别离得到的病毒株中判定出具有T22303G骤变。

有必要留意一下的是，和ZJU-5、ZJU-9参与同一会议的患者ZJU-4的病毒别离株有一个新的骤变A22301C，它在蛋白水平上（S蛋白中的S247R）导致了与T22303G相同的错义骤变。

最终，ZJU-11在ORF7b基因中有4个骤变，其间3个是接连的，并在蛋白水平上引入了2个骤变。

有必要留意一下的是，研讨人员认为，尽管GISAID中的序列数据对盯梢病毒的个别间变异十分有协助，但咱们依然对病毒的个别内进化动力学知之甚少。例如，在ZJU-4和ZJU-10中，两个独立位点的等位基因频率散布十分类似，这标明这两个位点或许是相关联的，提示在病毒种群中至少存在两种单倍型。

总的来说，尽管在这项研讨中只剖析了11株来自患者的病毒株，研讨人员仍查询到骤变多样性，包括现在在全球传达的不同首要病毒簇的几种根本骤变。这种多样性的骤变谱与它们相对较早的采样时刻和相对挨近武汉市是共同的。不过，因为样本量有限，武汉区域前期病毒的彻底变异多样性至今仍不清楚。

研讨人员评论指出，在11个病毒别离株中发现了多种骤变，包括现在感染全球人口的两大类病毒的两组鼻祖骤变。此外，尽管取样日期相对较早，31个已判定的骤变中有19个是新的，这标明病毒株的真实多样性在很大程度上仍未得到充分认识。

别的，T22303G骤变在5个病毒株中均查询到，这个特定的骤变在前期疫情中现已呈现，并或许在适当数量的武汉人身上都有。这或许是因为骤变的鼻祖效应，在这种效应情况下，T22303G骤变在前期并没有从我国传达出去。

有必要留意一下的是，ZJU-11的三核苷酸骤变是出其不意的。研讨人员留意到，这个特别的病毒别离株在研讨中的病毒载量和CPE测定中都显得十分“强有力”，其来历患者也十分罕见地继续45天新冠阳性，最近从医院出院。

他们都认为，研讨这种三核苷酸骤变的功用影响将是十分风趣的。有必要留意一下的是，在现在的数据库中，另一个三核苷酸骤变（G28881A, G2882A和G28883C）已被判定出，也导致了两个蛋白水平的错义骤变。

研讨人员还提示一点，与最近报导的不能从粪便样本中取得活病毒相反，这项研讨中有3个病毒别离株是从粪便样本中提取的，研讨标明新冠病毒能够在粪便样本中能够仿制。

体系发育剖析提醒不同的进化史

为了从已有的新冠病毒测序数据中了解11株病毒别离株的体系发育布景，研讨人员从GISAID（下载于2020年3月21日）取得了725个高质量、高掩盖的新冠病毒基因组，这中心还包括2013年在云南中华菊头蝠中搜集的RaTG13病毒株和广东穿山甲病毒株作为外群。

研讨人员构建了一个包括736个病毒序列的最大似然体系发育树，得到的体系发育树与GISAID上更新的体系发育剖析根本共同。

研讨查询到适当多的鼻祖骤变。具体来说，在这项体系发育剖析中，研讨人员留意到以下三个最大的簇：榜首、在231个病毒序列中发现三个核苷酸骤变C241T、C14408T和A23403G（S-D614G簇），大部分在欧洲别离取得；第二、在208个病毒序列中发现两个核苷酸骤变C8782T和T28144C（ORF8-L84S簇），在这项剖析中它们不是单源的(图2A和图S3)。但是，在ORF8-L84S簇内的92个基因组序列上能够查询到显着的单源亚支（subclade），首要由来自美国西雅图的病毒序列组成（ORF8-L84S-USA-WA-clade）；第三、在34个病毒序列中发现两个核苷酸骤变G11083T (ORF1a中的L3606F)和G26144T (ORF3a中的G251V)，其间大部分来自荷兰和英国。

研讨人员说到，还能够查询到几个由不同的鼻祖骤变集界说的较小的单源簇。例如：榜首、31个病毒序列发现了G1937A (ORF1a中的V378I)骤变；第二、12个病毒序列中发现了G1440A和G2891A骤变，导致了ORF1a基因的G392D和A876T骤变，大部分来自德国或荷兰；第三、8个基因组序列中发现了C15325T和C29303T骤变，导致了N基因的P344S骤变，来自我国或日本。

研讨人员将11株病毒别离株整合到体系发育剖析中，它们涣散在整个体系发育空间中。ZJU-1与ORF1a-L3606F和ORF3a-G251V组聚类，它一起具有这两种典型的骤变。另一方面，ZJU-2与ZJU-8和ORF8-L84S聚类，它们都有两个鼻祖骤变。因为上述T22303G骤变，ZJU-9和ZJU-11与澳大利亚的一个别离株聚类。其他毒株则或许骤变较少，或许没有与任何已知的大规模集体集合的新骤变，这反映了这11个样本的广泛多样性。

综上所述，研讨人员认为，一些单源病毒群的确表现出显着的地舆形式（特别是欧洲和美国），但这或许是因为在大盛行初期发作各自骤变的“鼻祖效应”。

感染Vero-E6细胞时，病毒拷贝数和细胞病理效应有显着差异

现在来看， COVID-19患者表现出多种临床症状，盛行病学研讨标明，临床成果受个别年纪、并发症和其他潜在不知道参数的严峻影响。为了检测患者来历的新冠病毒别离株的骤变影响，研讨人员进行了体外感染实验。

研讨人员首要检测了病毒别离株是否能如预期那样成功地与Vero-E6细胞结合，并以S蛋白构成的标志性“皇冠”来直观辨认病毒颗粒。然后，他们用一切11个患者来历的病毒别离株感染Vero-E6细胞，并在感染后1、2、4、8、24和48小时搜集细胞。在48小时和72小不时别离取细胞的DIC显微照片来评价CPE。

他们运用针对ORF1a、E和N基因的特异性实时转录聚合酶链反应(RT-PCR)来检测新冠病毒的存在。循环阈值Ct用于量化病毒载量，较低的值标明较高的病毒载量。因为这三个基因的成果高度共同，他们只评论ORF1a基因的成果。

扼要来说，一切病毒别离株样本感染后1、2、4小时的Ct值坚持平稳，仅有小的动摇。在这些较早的时刻点上，病毒粒子结合侵略细胞，病毒仿制在这个阶段很少发作。

在感染后8小时，研讨人员查询到ZJU-6、ZJU-7、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11的Ct值显着下降，即意味着病毒载量添加。感染后24小时，查询到除了ZJU-2和ZJU-7外，一切病毒别离株的Ct值都显着下降，其间一些病毒别离株，即ZJU-10和ZJU-11，下降速度比其他病毒快得多。感染后48小时，除ZJU-10和ZJU-11外，一切病毒别离株均有小幅度下降，研讨人员估测ZJU-10和ZJU-11在24小不时均已趋于稳定。

有必要留意一下的是，感染后24小时，ORF-8-L84S簇成员ZJU-2和ZJU-8（大部分来自美国华盛顿州西雅图）的病毒载量显着下降。另一方面，与S-D614G分支(首要在欧洲发现)同簇的ZJU-1病毒载量是ZJU-2和ZJU-8的19倍。此外，在感染后24小时，ZJU-10和ZJU-2的病毒载量相差近270倍。

论文说到，这些差异在48小时变得有统计学含义，在剖析基因E和N的数据时是可重复的。因而，研讨人员认为，不同的病毒别离株在感染Vero-E6细胞时表现出显着的病毒载量改变，这是由其基因组的不同骤变决议的。

接下来，研讨人员查验了病毒载量添加是否会导致更多细胞逝世。在感染后48小时和72小时显微镜下查询这些细胞系，CPE或细胞逝世率与病毒载量数据高度共同，标明病毒载量越高，细胞逝世率越高。

他们在评论环节说到，因为患者表现出的临床症状极为多样，在患者中树立基因型与表型的联络将是十分困难的。体外细胞系供给了一个抱负的体系，以查看不同的别离病毒株骤变的影响。

他们都认为，尽管Vero-E6细胞系并非来历于人，但Vero-E6细胞系的ACE2蛋白与人的ACE2蛋白高度类似，直接证明了新冠病毒能够感染该细胞系。

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